Mecanismos de proteólise 
e
 seus fundamentos
Victor Diaz Galban
Isis do Carmo Kettelhut
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Bioquímica

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1 - Introdução

    No final da década de 30, SCHOENHEIMER verificou que proteínas animais estão em um estado dinâmico, sendo continuamente sintetizadas e degradadas.Estudos de marcação metabólica em E. coli na década de 50 (HOGNESS et al., 1955), entretanto, concluiram que a degradação de proteínas tinha pouca importância, o que deve ter levado a um retardo na evolução do conhecimento nessa área. Até os anos 70, sabia-se que os lisossomas possuiam diversas proteases ácidas capazes de hidrolisar proteínas exógenas e autofagocitar constituintes celulares sob condições fisiológicas e patológicas variadas (DE DUVE e WATTIAUX, 1966).Durante a década de 60, estudos apontaram para a existência de proteases extralisossomais dependentes de cálcio, purificadas em 1976 por DAYTON et al. Nas décadas de 70 e 80, além de se conhecer melhor os componentes e as propriedades da proteólise lisossomal e extralisossomal dependente de cálcio, verificou-se a existência de uma via extralisossomal dependente de ATP e do polipeptídio ubiquitina (Ver HOCHSTRASSER para uma descrição mais detalhada). Esta via proteolítica tem demonstrado ser extremamente importante para diversos mecanismos regulatórios nas células, tais como transdução de sinais, controle do ciclo celular, endocitose mediada por receptores, transcrição gênica, controle de qualidade de proteínas, fornecimento de aminoácidos em estados de carência nutricional ou condições patológicas, apresentação de antígenos e apoptose. Além disso, existe uma via proteolítica independente de ATP, constituída por proteases que apresentam açoes específicas sobre um determinado substrato ( Há, por exemplo, diversas exopeptidases que liberam peptídios biologicamente ativos, enzimas que ativam ou inativam seus substratos por proteólise limitada, etc.).

2 - Proteólise lisossomal

    Tendo sido o primeiro sistema proteolítico intracelular identificado, atribuiu-se à proteólise lisossomal , inicialmente, toda a atividade degradativa do interior da célula, o que foi desmentido com a descoberta posterior de outras vias proteolíticas extralisossomais. No interior do lisossoma, foram identificadas diversas enzimas proteolíticas ativas em pH ácido, tais como as catepsinas B, C, D, H, L e outras, às quais se atribui a degradação de proteínas de meia-vida longa, de receptores de membrana e de diversas outras proteínas em condições de privação nutricional ( em tecidos como o fígado, o rim e o músculo cardíaco). Essa proteólise ocorre através de processos não seletivos, como a macroautofagia (fusão de lisossomas com vacúolos originários do Golgi e retículo endoplasmático liso) que é ativada sobretudo no fígado em períodos iniciais de jejum e a microautofagia (invaginação da superfície lisossomal que leva à produção de vesículas cujo conteúdo proteico sofre degradação no interior do lisossoma) e que ocorre sob condições nutricionais normais. Um processo seletivo tem sido descrito, pelo qual proteínas que apresentam a sequência de aminoácidos KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln) se ligam à proteina constitutiva de choque térmico hsc73 , de 73 kDa. O complexo assim formado se liga a um receptor na membrana lisossomal (lgp96), que promove a passagem da proteína a ser degradada para o interior do lisossoma; lá, uma molecula intralisossomal de hsc73 favorece a entrada da proteína que pode então ser degradada pelas proteases lisossomais.

Figura 1 - Mecanismos de proteólise lisossomal (adaptado de Cuervo e Dice,
                Cop. Springer-Verlag, 1998)

 

Figura 2 - O receptor para o complexo proteína-hsc73 (de Cuervo, A.M. e Dice, J.F. op.
                cit.)

 

Figura 3 - A via lisossomal seletiva envolvendo hsc73 (de Cuervo, A.M. e Dice, J. F., op.
                cit.). 1- reconhecimento do substrato pela hsc73 citosólica; 2- ligação à cauda
                citosólica de lgp96; 3- passagem do substrato para a matriz lisossomal;
                4- degradação pelas  proteases lisossomais.

    A via proteolítica lisossomal é importante na degradação de proteínas de membrana, proteínas que sofrem endocitose e na proteólise estimulada pelo jejum no fígado (mas não no músculo esquelético).

 

3 - Proteólise dependente de cálcio

    As proteases dependentes de cálcio, denominadas calpaínas, são cisteíno-proteases existentes nos diferentes tecidos em duas formas que diferem quanto à necessidade de cálcio para a sua atividade: a calpaína I é ativada em concentrações a partir de 10 µM de cálcio, enquanto a calpaína II é ativada a partir de 0,7 mM. Apresentam uma subunidade catalítica de 80 kDa, subdividida em 4 domínios ( o domínio II é a porção cisteíno protease, enquanto o domínio IV é a porção ligante de cálcio; não é clara a função dos outros dois domínios). Possuem também uma subunidade regulatória da sensibilidade frente ao cálcio (30 kDa), cuja porção amino terminal interage com fosfolipídeos de membrana. Uma terceira isoforma, a n-calpaína, foi descrita em músculo esquelético, apresentado uma subunidade catalítica de 94 kDa . Esta isoforma é ativada por concentraçoes na faixa de 10 a 1000 nM de cálcio, correspondendo à concentração fisiológica do mesmo. Sofre uma rápida autólise e parece estar envolvida no controle de proteínas regulatórias de vida curta, inclusive de fatores de transcrição e promotores de diferenciação das células musculares. Já, as calpaínas I e II regulam a transcrição através do controle dos níveis de c-jun e c-fos. Essas proteases parecem estar envolvidas, preferencialmente, no controle dos níveis de outras proteínas constituintes de vias metabólicas ou de transdução de sinal. No músculo causam uma proteólise limitada das miofibrilas podendo estar envolvidas em uma etapa inicial de sua degradação bem como no rearranjo da matriz do citoesqueleto.

    Foi descrito um ativador da calpaína II, que aumenta a conversão desta enzima para uma forma autolisada com necessidades de cálcio 25 vezes menores. Os mecanismos de ativação das calpaínas não são perfeitamente conhecidos, mas sabe-se que ocorre uma autólise dependente da ligação de íons cálcio e que uma seqüência amino terminal é removida no processo. As duas subunidades sofrem autólise e se dissociam. Também ocorre a dissociação do inibidor endógeno calpastatina, uma proteína de 48 kDa (nos eritrócitos) ou 73 kDa (em outros tecidos). Ver BELCASTRO et al. ,1998.

4 - Proteólise dependente de ATP e Ubiquitina

    Uma via proteolítica de fundamental importância para a viabilidade celular, o sistema proteolítico dependente de ATP e ubiquitina é formado por uma protease de peso molecular entre 1000 a 1500 kDa, composta por subunidades de 34-110 kDa e com um coeficiente de sedimentação de 26S, daí ter surgido a sua denominação mais aceita atualmente: proteassoma 26S. Este, por sua vez, é formado por um núcleo catalítico no formato de um cilindro oco, denominado proteassoma 20S e uma porção 19S na qual se localizam ATPases responsáveis pelo desenovelamento das proteínas a serem degradadas pelas atividades proteolíticas residentes em 20S. Além disso, na subunidade 5 de 19S ocorre a ligação das cadeias de poli-ubiquitina, que marca a proteína ao qual está ligada para a degradação (ver figura 4) . A ubiquitina é uma proteína de 76 resíduos de aminoácido, peso molecular 8500 Da, que é expressa em todas as células eucarióticas, onde é sintetizada a partir de genes múltiplos como produtos de fusão N-terminal com outras proteínas ou oligômeros cabeça-cauda e clivadas por peptidases que liberam mono-ubiquitinas. As moléculas de ubiquitina se ligam aos substratos por meio  de ligações isopeptídicas entre o resíduo de glicina C-terminal da ubiquitina e os grupos amino - épsilon de resíduos de lisina das proteínas. Cadeias de poli-ubiquitina se formam  a partir da adição de moléculas de ubiquitina ao resíduo de lisina-48 de uma outra molécula de ubiquitina.

    A marcação dos substratos a serem degradados ocorre através de uma cascata multi-enzimática nas quais enzimas se ligam à ubiquitina por meio de ligações tiol-ésteres: inicialmente, ocorre a ativação da ubiquitina   pela enzima ativadora de ubiquitina (E1, 117 kDa), que leva à formação de uma ligação tiol-éster entre um resíduo de cisteína de E1 e a extremidade C-terminal da ubiquitina. Em seguida, ocorre uma trans-acilação para um resíduo de cisteína de E2 (enzima conjugadora de ubiquitina), da qual existem pelo menos 10 isoformas , apresentando especificidade com relação à função da ubiquitinação; assim, há enzimas E2 que transferem ubiquitina para proteínas básicas, como as histonas, na ausência da enzima subsequente (E3) e que participam de vias envolvidas no controle do ciclo celular e reparo de DNA. Já, outras atuam na presença de E3 e são específicas para a via de degradação proteica.  E3, ubiquitina-proteína ligase é uma  enzima chave por sua especificidade frente ao substrato proteico: existem pelo menos quatro tipos distintos, reconheciendo substratos proteicos com resíduos amino terminais básicos (tipo I); hidrofóbicos volumosos (tipo II); serina,alanina ou treonina (tipo III) e outros com determinantes independentes do resíduo amino terminal (tipo IV). Proteínas com resíduos amino terminais ácidos ou cisteínico  são arginiladas pela arginil-tRNA proteína transferase (parte integrante do proteassoma 26S). As proteínas acetiladas são reconhecidas, possivelmente por uma outra E3. O resíduo amino-terminal é, sem dúvida, uma parte importante para determinar a suscetibilidade à proteólise; isso foi demonstrado por Varshavsky e colaboradores que verificaram por mutagênese do resíduo amino terminal de beta-galactosidase , que alguns resíduos levavam a meias-vidas longas (maiores do que 30 min), enquanto outros encurtavam esse tempo. Sabe-se, entretanto, que o estado de oxidação e de desnaturação e a disposição dos resíduos de lisina são também importantes para determinar a suscetibilidade frente  à proteólise.

     Os substratos proteicos ubiquitinados devem estar desenovelados, a fim de penetrar no canal de 13 A da subunidade catalítica do proteassoma 26S. Isto é conseguido às custas de energia produzida pela hidrólise de ATP por ATPases presentes na subunidade regulatória 19S, que pode também alterar a abertura desse canal.  A subunidade catalítica (o proteassoma 20S) é formada por 4 aneis cada um formado por 7 subunidades alfa ou beta, num arranjo alfa-beta-beta-alfa (fig   4). Nas subunidades beta residem os sítios catalíticos de treonina. As atividades proteolíticas são semelhantes às de trispina, quimotrispina, havendo ainda uma atividade hidrolítica de ligações peptídicas peptidil-glutamil. Observa-se, pela fig 4B, que o as subunidades 20S e 19S requerem ATP para se associar e formar o proteassoma 26S.

    Um ativador (PA28 ou 11S) foi descrito como estimulador das atividades peptidásicas do proteassoma, ligando-se ao proteassoma 20S no lugar da subunidade 19S. Atua possivelmente para completar a degradação de peptídios formados numa primeira etapa degradativa (embora não haja liberação de peptídios para fora do proteassoma). Um inibidor foi identificado com a proteína de choque térmico HSP90. Por último, verificou-se que existem atividades de desubiquitinação, que liberam ubiquitina livre, que pode novamente entrar no ciclo degradativo.   

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A

 

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B

Figura 4 - A) Estrutura do proteassoma 26S e b)Formação a partir do proteassoma 20S e do complexo regulatório 19S (C- Current Biology)

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Figura 5 - A proteólise dependente de ATP e ubiquitina (C- Current Biology)

 

    Existe ainda, nas células, uma via não lisossomal independente de cálcio e de ATP. Possivelmente, algumas peptidases e proteases que foram encontradas no citoplasma celular   ( como a tripeptidil peptidase II, a leucina aminopeptidase, a endopeptidase 24-11, a catepsina E, a enzima conversora de interleucina-1-beta - integrante de uma família denominada "caspases" que parecem ser importantes na apoptose, assim como a serina protease granzima) são as responsáveis por essa atividade, da que se espera ter um melhor conhecimento nos próximos anos.

 

 

5 - Regulação da proteólise intracelular

 

      Observando as características estruturais das vias proteolíticas e considerando que, do ponto de vista termodinâmico, a hidrólise das ligações peptídicas é um processo que não requer energia, a pergunta que pode ser feita é: por que as vias mais gerais de degradação protéica exigem energia e/ou  vias regulatórias complexas.  A resposta está na necessidade de uma seletividade que garanta apenas a degradação dos substratos necessários  sem que ocorra uma proteólise generalizada, que seria letal. Uma outra questão importante é: para que a proteólise é necessária? Em condições normais, uma série de eventos regulatórios baseiam-se na degradação proteica: a via dependente de cálcio regula a transcrição pelo controle dos níveis de c-jun e c-fos, a diferenciação de células musculares, a estrutura do citoesqueleto e os níveis de diversas proteínas regulatórias. A via dependente de ATP e ubiquitina atua na degradação de proteínas anormais - oriundas de mutações, erros biossintéticos ou danos causados por agentes físicos e químicos, inclusive proteínas mal formadas no retículo endoplasmático; na degradação de ciclinas e outras proteínas necessárias para o ciclo celular; na degradação de fatores de transcrição ( como I kappa B e p105, o que causa a ativação de NF kappa B, p53, E6 viral, c-jun). É também responsável pela degradação de proteínas miofibrilares e da degradação necessária para renovar proteínas de vida longa ou curta. Por sua vez, a via lisossomal está envolvido na degradação de receptores localizados na membrana ( os transmembrânicos parecem ser degradados pelo proteassoma) e de proteínas extracelulares, além de uma degradação basal pela microautofagia.

    Em estados fisiologicamente alterados ou mesmo em diversas patologias, ocorre a ativação de diferentes vias, variando conforme a condição e o órgão em questão. Essas mudanças são induzidas por alterações dos níveis de diversos hormônios:

     0 jejum leva a um aumento da proteólise lisossomal no fígado (mas não no músculo) através do aumento da macroautofagia (até o segundo dia de jejum, no rato) e da via seletiva mediada por hsc73 (após 2-3 dias). Isto implica em se passar de uma via não seletiva para uma via seletiva, o que é importante na preservação de proteínas essenciais para a manutenção da viabilidade celular.Essa via seletiva pode reduzir a glicólise e  componentes da via proteolítica dependente de ATP e ubiquitina ( o proteassoma 26S é degradado por essa via!). A macroautofagia é inibida por insulina e estimulada por glucagon - o parâmetro fundamental parece ser a razão insulina/glucagon. Os fatores de crescimento semelhantes à insulina exercem efeito análogo ao da insulina; também os aminoácidos inibem a proteólise lisossomal. O diabetes acarreta no fígado, pelo exposto, um aumento da proteólise lisossomal. No músculo não se verificam alterações da proteólise lisossomal quer com o jejum quer com o diabetes.  A proteólise lisossomal parece ser importante em músculos desnervados, contribuindo para a atrofia muscular. Hormônios tiroideanos ativam a via lisossomal, assim como hormônios hipofisários.

    A atividade da via dependente da cálcio normalmente não se correlaciona com as variações na proteólise total observada numa dada situação fisiológica ou patológica, à exceção daquelas, como as distrofias musculares, a desnervação  ou o exercício, em que se encontram  aumentadas as concentrações intracelulares de cálcio. Resultados de nosso laboratório mostraram uma ativação no primeiro dia de diabetes experimental induzido por estreptozotocina em ratos, nos músculos sóleo e EDL, retornando ao normal aos 3 dias (cinco, no caso do EDL), indicando que esta via pode participar de eventos importantes em períodos iniciais de diabetes. Hormônios anabolizantes parecem diminuir esta via. 

    O sistema proteolítico dependente de ATP e ubiquitina é estimulado em diversas situações como o jejum, o diabetes e a desnervação muscular.Além do efeito inibitório de insulina e dos IGFs há que se considerar que glicocorticoides e hormônios tireoideanos estimulam a proteólise dependente de ATP e ubiquitina. Algum fator hipofisário também estimula a proteólise (o hormônio do crescimento não o faz).

    Em resumo, as células possuem diversas vias   proteolíticas que podem ser ativadas ou inibidas de acordo com as suas necessidades em diferentes estados nutricionais e patológicos.  A existência de diversas fases temporais desde o estabelecimento de determinada condição é um indicativo de que as diferentas vias proteolíticas podem atuar em mecanismos adaptativos mediados por ação hormonal. Ainda pouco se sabe sobre os mecanismos bioquímicos envolvidos nessas situações, mas a própria existência de diferentes vias, algumas delas exibindo um elevado grau de complexidade nos permite dizer que a degradação proteica intracelular é um processo vital extremamamente bem regulado por diversos fatores internos e externos às células.